引言
自 1977 年弗雷德里克 Sanger 提出双脱氧链终止法以来，sanger测序链终止剂（也称 dideoxynucleotide，缩写 ddNTP）一直是核酸测序技术的核心化学试剂。它们通过阻断 DNA 链的延伸，使得在特定位置产生终止片段，进而通过电泳或毛细管分离实现序列读取。本文将从化学结构、工作机制、常用种类、实验优化以及最新进展等多维度，对 sanger测序链终止剂进行系统、深入的剖析，帮助科研人员在实验设计和结果解析中做到胸有成竹。
Sanger 测序的基本原理
双脱氧链终止剂的作用机制
在 DNA 聚合酶的催化下，普通的脱氧核苷酸（dNTP）通过 3′‑羟基与前一核苷酸的 5′‑磷酸形成磷酸二酯键，实现链的延伸。sanger测序链终止剂缺失 3′‑羟基，仅保留 2′‑羟基，导致一旦被掺入 DNA 链后，后续的核苷酸无法再接上，从而产生链的终止。这种“终止-延伸”交替的随机过程，使得在同一反应体系中产生长度各异的 DNA 片段，正是后续分离和读取的基础。
毛细管电泳与荧光标记
传统的凝胶电泳已逐步被毛细管电泳取代。现代 Sanger 测序常使用四种不同荧光染料分别标记四种 ddNTP（ddA、ddC、ddG、ddT），在电泳过程中依据荧光信号的顺序重建 DNA 序列。此时，sanger测序链终止剂的纯度、荧光标记的稳定性直接决定了测序质量。
常见的链终止剂种类与化学特性
| 终止剂 | 化学式 | 常用浓度 (µM) | 荧光标记 | 备注 |
|---|---|---|---|---|
| ddATP | C10H13N5O2P | 0.2‑0.5 | FAM (绿色) | 对 AT 富集区有较好信号 |
| ddCTP | C9H13N3O2P | 0.2‑0.5 | HEX (黄色) | 对 GC 区域信号稍弱 |
| ddGTP | C10H13N5O2P | 0.2‑0.5 | TAMRA (红色) | 易受二价金属离子抑制 |
| ddTTP | C9H13N2O2P | 0.2‑0.5 | ROX (橙色) | 与 DNA 聚合酶亲和力最高 |
纯度与稳定性
商业供应的链终止剂通常以无水粉末或冻干液体形式提供。sanger测序链终止剂的纯度需 ≥ 99%，否则微量的 dNTP 污染会导致终止效率下降，出现“跳峰”或“拖尾”。在使用前，建议在-20 ℃保存，并在每次使用前进行短暂的离心除去可能的结晶。
实验体系的优化策略
终止剂与 dNTP 的比例
经典配方为 ddNTP : dNTP = 1:10‑1:20。比例过高会导致链过早终止，片段分布偏短；比例过低则终止信号弱，测序峰形不清。通过梯度实验（如 1:5、1:10、1:15）可以找到最适合特定模板的最佳比例。
聚合酶的选择
常用的 Taq DNA 聚合酶在高温下活性强，但对 ddNTP 的接受度相对较低。Phusion、Pfu 等高保真酶对链终止剂的亲和力更好，能够在较低的 ddNTP 浓度下实现均匀终止，提升读长与准确率。
缓冲体系与金属离子
Mg²⁺是 DNA 聚合酶的必需辅因子，但过量 Mg²⁺会抑制 ddNTP 的掺入。一般推荐 MgCl₂ 浓度在 1.5‑2.0 mM 之间。对于含有 ddGTP 的体系，适当加入少量 Mn²⁺（0.1‑0.2 mM）可提升终止效率，但需控制好浓度，以免引入误差。
常见问题与故障排查
- 峰形拖尾：可能是 ddNTP 纯度不足或聚合酶活性下降。更换新鲜的链终止剂或使用高保真酶可改善。
- 信号弱或缺失：检查荧光标记是否被光漂白，或终止剂浓度是否过低。适当提高 ddNTP 用量或更换荧光染料。
- 背景噪声增大：常见于模板 DNA 含有二级结构。加入 DMSO（5%‑10%）或使用热启动聚合酶可降低噪声。
前沿进展与未来趋势
纳米孔测序的竞争与互补
尽管第三代测序（如纳米孔）在长读长方面具有优势，但在高准确度的单核苷酸变异检测上，sanger测序链终止剂仍保持不可替代的地位。未来可能出现将链终止剂与纳米孔技术相结合的混合平台，实现高通量与高精度的双重优势。
绿色合成与成本降低
传统 ddNTP 的合成工艺涉及大量有机溶剂和高能耗步骤。近年来，生物酶催化合成路线逐渐成熟，能够在水相中高效生成 ddNTP，降低环境负担并降低成本，为大规模临床检测提供经济可行的解决方案。
多重荧光标记与机器学习解读
新一代荧光染料拥有更窄的发射波段和更高的光稳定性，能够在同一次测序中实现六色甚至八色标记。配合机器学习算法对峰形进行自动校正，预计可以进一步提升测序通量与准确率。
结论
sanger测序链终止剂是 DNA 测序技术的基石，其化学结构、纯度、配比以及与聚合酶的相互作用决定了测序的质量与可靠性。通过合理的实验设计、体系优化以及对新技术的持续关注，科研人员可以最大化地发挥链终止剂的优势，在基因组学、临床诊断以及生物技术研发中保持领先。未来，随着绿色合成、荧光标记多元化以及跨平台整合的不断推进，sanger 测序仍将在精准医学和基因检测领域发挥不可替代的作用。
关于sanger测序链终止剂的常见问题
1. sanger测序链终止剂与普通 dNTP 的区别是什么？
链终止剂缺失 3′‑羟基，掺入 DNA 链后会导致链的延伸停止；而普通 dNTP 具备完整的 3′‑羟基，可继续延伸。正是这种结构差异使得测序过程中产生长度不同的终止片段。
2. 如何选择合适的 ddNTP 与 dNTP 比例？
一般建议 ddNTP 与 dNTP 的摩尔比为 1:10‑1:20。具体比例需根据模板长度、GC 含量以及所用聚合酶进行梯度实验，以获得最佳峰形和读长。
3. 链终止剂的荧光标记会影响测序结果吗？
会。不同荧光染料的光稳定性、发射波长和与聚合酶的兼容性各不相同。选用高光稳定性且与仪器激光匹配的染料，可显著提升信号强度并降低背景噪声。
4. 长片段测序时链终止剂会出现“跳峰”现象吗？
在高 GC 区域或二级结构较强的模板上，链终止剂的掺入效率可能下降，导致部分片段提前终止或出现跳峰。加入 DMSO、降低 Mg²⁺浓度或使用高保真聚合酶可有效缓解。
5. sanger测序链终止剂的保存条件有哪些注意事项？
应保存在 -20 ℃的干燥环境中，避免反复冻融。使用前建议短暂离心除去可能的结晶，并在无水条件下配制工作液，以保证其活性和纯度。
主题测试文章，只做测试使用。发布者：币安赵长鹏，转转请注明出处：https://www.binancememe.com/121554.html
